Methode zum Einlesen von emittierten Lichtsignalen, die in ein Bildsignal umgewandelt werden

Molecular Dynamics gehörte im Jahre 1989 zu den ersten Anbietern des PhosphorImagers ^TM. Inzwischen bringen Fuji, Bio-Rad und Canberra Packard ähnliche Geräte auf den Markt. ^[1]

Die molekularbiologische Verfahren wie Souther-Hybridisierung, FISH und DNA – Sequenzierung nutzen die Markierung der DNA als grundlegende Methode.

Während des Verfahrens emittiert der Marker ein Signal, welches ein bestimmtes DNA – Molekül erfasst. Das zu bestimmende DNA – Molekül kann auf Nitrocellulose- oder Nylonmembran in einem Chromosom oder in einem Gel ermittelt werden.

Die Markierung der DNA – Moleküle erfolgt meistens mit radioaktiven Markern. Eine Bildung von Nucleotiden wird durch das Ersetzen von einem Phosphoratom des ³²P oder ³³P hervorgerufen, einem Sauerstoffatom der Phosphatgruppe durch ³⁵S oder eines der mehreren Wasserstoffatome durch ³H.

Die radioaktiven Nucleotide sind noch immer Substrate der DNA – Polymerasen und werden in das DNA – Molekül durch jede strangsynthetisierende Reaktion, die dieses Enzym katalysiert, eingebaut.

Es ist möglich die markierten Nucleotide oder einzelne Phosphatgruppen an ein oder an beide Enden eines DNA – Moleküls anzuhängen.

Diese Zusammenführung erfolgt durch Reaktionen, die von T4 Polynucleotid – Kinasen oder Terminale Desoxynucleotidyltransferasen erzeugt werden. 

Durch Szintillationszählung kann das radioaktive Signal gemessen werden, hierfür ist die Bestimmung der Position des Signals jedoch zwingend. Daher wird eine Lokalisierung durch das Auflegen eines Röntgenfilms (Audioradiographie) oder eines strahlungssensitiven Schirms (PhosphorImaging) benötigt.

Die Bestimmung der radioaktiven Markierungsart erfolgt je nach Erfordernis der angewendeten Methode.^[2]

Die Methode des PhosphorImagers findet Anwendung in radioaktiven Isotopen (β- und ɣ- Strahler wie ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ³³P, ¹²⁵I, ¹³¹I) und in UV-Licht. Die Autoradiographie von radioaktiven Gelen, Membranen, Dünnschichtplatten oder Geweben erfolgt auf einer speziellen PhosphorImagerplatte im PhosphorImager.^[3]

Die Technik, storage phosphor, funktioniert unter der Voraussetzung eines mit BaFBr: Eu-Kristallen beschichteten Schirms (screen), dabei werden die Elektronen in den Kristallen durch ionisierende Energie in einen angeregten, aber stabilen Zustand (Eu → Eu²⁺) überführt. Die exponierte Platte wird im PhosphorImager mit Laserlicht definierter Wellenlänge angeregt und das emittierte Lichtsignal vom Gerät in ein Bildsignal umgewandelt. Es erfolgt die Anregung in einen instabilen Zustand (Eu²⁺ → Eu³⁺). Die Elektronen fallen in ihren Grundzustand zurück (Eu³⁺→ Eu), so dass ein Quäntchen Licht abgegeben wird. Die Bildauswertung wird im Computer quantifiziert und analysiert.^[1]

Die Anwendung des PhosphorImagers ist 10 – 100mal empfindlicher als Röntgenfilme und gewährleistet somit schnellere Ergebnisse bzw. detektiert auch schwächere Signale. Die Expositionszeiten sind viel kürzer als bei Röntgenfilmen. Das System wird weniger schnell gesättigt, d.h. dass sowohl sehr starke als auch sehr schwache Signale alleine durch eine einzige Exposition erfasst werden können. Da der lineare Signalbereich bei über 5 Größenordnungen (100 000 : 1) liegt, ist die Methode für Quantifizierung besser geeignet als Röntgenfilme, so dass das Erfassen der Daten auf Anhieb densitometrisch ausgewertet werden kann.^[1]

Der PhosphorImager ist eine schnelle, aber kostspielige (je nach Ausstattung ab 40.000 €) Methode. Die auf dem Screen gespeicherten Signale sind zwar wiederverwendbar, aber empfindlich gegen Kontamination mit radioktiven Sonden. Sowohl die Kosten der Screens sind sehr hoch (ab 750 €) als auch die Auflösung dieser Methode mit ≥ 50 μm geringer als beim Röntgenfilm.^[1]

Beispielsweise ist für das Phosphoratom ³²P eine hohe Sensitivität gegeben, da dieses Isotop über eine hohe Strahlungsenergie besitzt. Jedoch führt diese hohe Strahlungsenergie zur starken Streuung mit einer geringen Auflösung. Eine bessere Auflösung weisen die Isotope ³⁵S und ³H auf, sie verfügen über eine geringe Emission und sind weniger sensitiv.^[2]

Ebenfalls werden für die Hybridisierungsanalyse mittels DNA – Microarrays und Chips radioaktive Markierungen genutzt.

Die Signale werden durch PhosphorImaging elektronisch nachgewiesen, dabei kann die Methode jedoch nicht für Chips mit einer extremen Dichte angewendet werden, da dann nur eine geringe Auflösung erreicht wird.

Bedingt durch Gründe wie Gesundheit und Umweltschutz werden radioaktive Substanzen in den letzten Jahren immer seltener verwendet, so dass eine Anwendung von nichtradioaktiven Alternativen erfolgt. Zu den nützlichsten Alternativen zählt die Verwendung von fluoreszierenden Marken, diese bilden die wesentlichen Elemente von Methoden wie FISH und DNA – Sequenzierung.^[2]

• Friedrich Lottspeich, Joachim W. Engels (Hrsg.): Bioanalytik. 3. Auflage. Springer Spektrum, Berlin 2012, ISBN 978-3-8274-2942-1
• Monika Jansohn (Hrsg): Gentechnische Methoden Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor. 4. Auflage. Spektrum, München 2007, ISBN 3-8274-1537-3
• Hans - Joachim Müller, Thomas Röder: Der Experimentator Microarrays. 1. Auflage. Springer Spektrum, München 2004, ISBN 3-8274-1438-5
• Gerhard Richter: Praktische Biochemie Grundlagen und Techniken. 1. Auflage. Thieme Verlag Stuttgart 2003, ISBN 3-13-132381-7

• Inhibition von Proteinkinasen der Proteinkinase C Familie  durch das Nichtstrukturprotein 3 des Hepatitis C Virus [https://www.chemie.uni-hamburg.de/bibliothek/2007/DissertationHartjen.pdf]
• Material und Methoden [https://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/05/05H101/t3.pdf]
• Immunantwort ex-vivo-differenzierter dendritischer Zellen bei Infektion mit dem intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii [https://www.researchgate.net/publication/33958938_Immunantwort_ex-vivo-differenzierter_dendritischer_Zellen_bei_Infektion_mit_dem_intrazellularen_Parasiten_Toxoplasma_gondii_Elektronische_Ressource]

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1. ↑ ^{a b c d} Cornel Mülhardt: Der Experimentator Molekularbiologie/Genomics. Hrsg.: Springer Spektrum. 7. Auflage. Springer Spektrum, Berlin/Heidelberg 2013, ISBN 978-3-642-34635-4, S. 172. 
2. ↑ ^{a b c} T.A. Brown: Genome und Gene Lehrbuch der molekularen Genetik. 3. Auflage. Spektrum, Berlin Heidelberg 2007, ISBN 978-3-8274-1843-2, S. 36, 78. 
3. ↑ Kathy Barker: Das Cold Spring Harbor Laborhandbuch für Einsteiger. 1. Auflage. Spektrum, München, ISBN 3-8274-1656-6, S. 32.